阳离子脂质体介导基因转染效率影响因素（舜纳纳米核酸递送载体技术）_公司新闻

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阳离子脂质体介导基因转染效率影响因素（舜纳纳米核酸递送载体技术）

人阅读发布时间：2020-12-28 00:12

  目前研究者已对阳离子脂质体开展大量研究，明确主要工作就是试图从提高转染效率、提高生物降解性和降低毒性等方面寻找有应用前景的脂质体。由于阳离子脂质体分子由阳离子头部、连接键和疏水烃尾三部分构成，它们都会对脂质体的转染效率产生影响；此外，还会在形成脂质体的阳离子类脂分子上连接靶向性配体来提高基因转染效率。现分别从阳离子脂质体的几个结构部分对转染效率的影响进行讨论。

1. 连接键的影响
连接键决定了阳离子脂质体的化学稳定性及被生物降解的能力。连接键类型对转染效率和毒性会产生影响。在最早研究的类脂分子中，极性与非极性的连接键多为醚键，醚是一种很稳定的化合物，转染后在体内不易分解，容易积存从而对人体产生毒性。针对这个问题，易分解的酯键引起人们重视，酯键可以被有效降解代谢，却又不够稳定，采用这种连接键的脂质体往往在未到达目标组织时便已在循环系统中分解，从而影响转染效率。类似的还有酰氨键，虽能降解，但转染活力小，且稳定性不好。

近年趋势是双功能阳离子脂质体，即用连接键将亲水部分与亲油部分连接，再将靶向性配体连接到亲油部分；亲水部分为多聚阳离子，增加对DNA的结合力度，综合脂质体与多聚阳离子的优点。连接键仍主要是醚键、酯键和酰胺键，这些连接键仍旧存在转染效率和细胞毒性方面的问题。Boomer提出采用对pH值敏感的烯醇醚键作为连接键，它在中性条件下稳定，而在酸性条件下则易于水解。细胞内的pH值一般比细胞外低1～2，进入细胞后类脂分子酸性水解将DNA释放，可以提高转染效率和降低毒性。类似的还有氨基甲-酸酯键，如二叔丁基二碳酸酯就常用来在中性条件下与氨基反应形成氨基甲-酸酯键，而在酸性条件下被水解掉。因此，由氨基甲-酸酯键连接的阳离子类脂也可提高转染效率和降低细胞毒性。LeeE.R.等采用氯甲-酸胆固醇酯和多胺反应，生成了氨基甲-酸酯连接键的胆固醇基阳离子类脂，考察了胆固醇基和多胺头部对转染效率的影响，发现有较高的转染效率，而且随氨基数增加(3～4个)，转染效率降低。

2. 阳离子头部与疏水烃尾的影响
通常认为脂质体阳离子头部所带正电荷越多，转染效率就越好，但细胞毒性也越大。不过也有特例，有人研究发现，一种含有多个正电荷的树枝状头部的阳离子脂质体和带一个正电荷的DOTAP相比，在显著提高转染效率的同时细胞毒性却基本没有变化。疏水烃尾的长度以及饱和度通常影响脂膜的柔性和流动性，进而影响脂质体DNA复合物的稳定性。本课题组在进行疏水烃尾的长度对转染效率的研究中发现，当其它条件相同时，在12～18碳长的阳离子类脂中，疏水烃尾为12碳长时转染效率最高。

在筛选脂质体结构时，需综合考虑这些因素，根据不同需要选择出最合适的阳离子脂质体分子结构。Lee等按照疏水基团、亲水基团及连接基团的不同先后设计合成了三类60余种不同结构的阳离子脂质体。第一类阳离子脂质体的疏水基团为胆固醇，连接基团为氨甲酰基，亲水基团为带不同氨基数量的链状氨基化合物。第二类阳离子脂质体疏水基团、亲水基团与第一类类似，但连接基团为氨基或其它基团。第三类阳离子脂质体连接基团与第一类相似，而疏水基团则为两条长链脂肪酸。通过对上述三类阳离子脂质体进行测试比较，发现第一类阳离子脂质体效果最好。其中疏水基团为胆固醇、连接基团为氨甲酰基、亲水基团为精胺的阳离子脂质所制备的阳离子脂质体其转染效率最高，约为目前商品化阳离子脂质体转染效率的100多倍。1999年，Tang等发现在阳离子脂质体上引入二硫键也可提高转染效率。

3. 靶向性基团的影响
在阳离子载体的结构设计中，常用细胞表面特异表达的受体或蛋白来解决靶向性的影响。所谓特异表达是指某些细胞常常能表达出大大多于其它细胞的表面受体。靶向基因传递正是利用了细胞表面受体的差异性，在类脂分子的疏水尾链部分连接了能与这种受体产生特异结合的配体。由这种类脂分子形成的阳离子脂质体DNA复合物会选择性地与受体过度表达的细胞结合，使治疗基因在病变细胞附近富集，提高基因的转染效率。例如，由于哺乳动物肝实质细胞存在一类能专一识别以非还原半乳糖或N2乙酰半乳糖为末端的糖蛋白或糖脂的受体。有人曾经通过在PEG脂质体表面连接半乳糖的衍生物来实现肝癌细胞对常规药物的特异性识别，从而达到靶向性的目的，效果良好，能显著提高转染效率^[33^，^34]。常用的靶向性配体有：单克隆抗体，转铁蛋白，叶酸，维生素D，半乳糖等。

4．脂质体DNA复合物的正负电荷比例影响
研究显示阳离子脂质体与质粒的不同比例（即电荷比）对脂质体DNA复合物的大小和形态有影响，并进一步影响到基因的转染效率，当复合物中阳离子脂质体的正电荷与核酸的负电荷在1∶1或以上时，核酸转运的效果最佳。对于这一比例的确定存在着不同看法，但普遍认为应大于1。脂质体DNA复合物带有过量正电荷对转染很关键。由于细胞膜和血清蛋白都带负电荷，可使DNA从复合物中分出而降解，而过量的正电荷可以减小或消除这些影响。不过也有人发现，极少数情况下，正负电荷比例小于1，复合物带负电荷并不影响效率，可能是因为只有部分DNA与脂质体形成复合体，或者细胞表面有DNA的特异受体。基因结构通常DNA比RNA较易被引入细胞，因为RNA易降解且不像DNA那样最终整合到染色体上。此外，也有人发现，异源基因内区位置及启动子等因素可影响表达层次。

5. 阳离子脂质体制备方法的影响
目前传统脂质体的主要制备方法有薄膜法、反相蒸发法、钙融合法、去污剂法及挤出器法等，它们都是先用有机溶剂或表面活性剂溶解磷脂，得到粗制的磷脂双层膜，然后对膜进行水化处理，再通过适当方法得到不同大小的脂质体。但由于工艺本身的缺陷、有机溶剂或表面活性剂的残留都会导致DNA的生物活性降低，而且很难实现大批量脂质体的制备。新的方法有加热法、超声波法、CO₂超临界法等，对于不同的脂质体，不同的制备方法可以得到不同的包封率，进而影响DNA的转染率。所以，应根据具体情况选择合适的制备方法或者在现有的方法基础上进行改进。Templeton认为用011μm的滤器挤压脂质体，可造成内陷结构，使之具有大的表面积。温和的超声波处理比高频的超声波处理效果好。Smith认为DNA可引起脂质体融合，故DNA加入脂质体以及将形成的复合物注入组织的时间间隔也会影响效果。Gao和Huang发现转染效率与加入辅助分子与阳离子脂质体的顺序也有关。若阳离子脂质体已与DNA形成复合物再加入辅助分子则无效果，应先把DNA与辅助分子混合再加阳离子脂质体。

另外，细胞或组织类型不同，转染效果也会有差异。如转化脂可转染DNA进入多种组织细胞，但对小鼠胎儿脑细胞的转染能力则很低。脂质体DNA复合物的稳定性好，基因进入细胞质或细胞核的效率高，则阳离子脂质体的转染效率可能高。血清或转染抑制剂的存在，可降低阳离子脂质体的转染活性，甚至抑制转染。欢迎关注我们的科研产品Cas9编辑基因阳离子囊泡（SN-NP-R51）

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