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小干扰RNA体内递送的纳米载体技术 (核酸药物载体 舜纳纳米)

发布时间:2020-02-05 17:21 |  点击次数:

 

        RNA干扰(RNA interference,RNAi)的发现与研究,为基因治疗带来了新的契机,其已发展成为一种非常有潜力的基因治疗手段。1998 年,Kim WJ等[1]在线虫体内首次发现双链RNA(Double strand RNA,dsRNA)能使基因表达沉默。外源性dsRNA 进入细胞后,可被Dicer 酶识别加工成21~23 个核苷酸的短链RNA,即为小干扰RNA(siRNA)。siRNA 进入细胞后,可与细胞质中的蛋白质形成RNA诱导沉默核酸蛋白复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),与序列互补的靶mRNA 结合,对mRNA 进行酶切,阻断相应蛋白的翻译。siRNA 具有特异性、高效性,是特异性抑制基因表达的强效方法。目前,RNAi技术已用于肿瘤、癌症、糖尿病以及基因探测等。但是,siRNA 在体内易被核酸酶快速酶解,其跨细胞膜转运能力弱、半衰期短、体内基因沉默效率很低。因此,siRNA需要借助合适的、安全的、有效的体内递送系统才能很好地发挥治疗作用。

        目前,siRNA 的递送策略主要分为物理策略、共价结合策略以及病毒和非病毒载体递送策略。近年来,纳米微粒递送系统如纳米粒、纳米颗粒、树枝状聚合物以及脂质体等用于体内递送siRNA备受青睐并被广泛应用研究,其能够改善siRNA体内稳定性,增强靶向特异性,提高细胞/组织对siRNA 的摄取,最终提高基因沉默效率,降低毒副作用。因此,现对现行siRNA 纳米微粒系统的体内递送研究现状进行整理,为开发新型体内递送siRNA纳米微粒系统开阔思路。

        纳米微粒系统用于体内递送siRNA阳离子共聚物纳米微粒系统:阳离子共聚物能与siRNA通过静电吸附作用而自组装呈纳米微粒,从而有效防止siRNA 被核酸酶降解。阳离子共聚物由于合成简便、储存稳定、基因荷载率高、免疫原性低等优点而被广泛用于荷载siRNA 制备纳米微粒复合物。然而,转染效率低是合成纳米载体存在的最大问题。因此,后续研究可考虑采用靶向配体修饰共聚物,利用受体介导的靶向作用增加细胞或者组织的摄取等。其中PEI 与树枝状聚合物是近年来研究最为广泛的阳离子共聚物。生理条件下,PEI 分子中有1/6~1/5 的氮原子是质子化的,具有“质子海绵效应”,高的电荷密度及较强的缓冲能力,能增强siRNA 纳米微粒从内涵体中释放。以小鼠皮下注射肿瘤细胞作为肿瘤模型,小鼠腹腔注射荷载siRNA PEI 纳米微粒系统后,肿瘤细胞生长速度较对照组显著减慢,但PEI 分子表面高的正电荷密度会导致严重的细胞毒性,限制其应用。因此,可通过对PEI 进行结构修饰以降低毒性并保持基因递送效率。PEG 修饰的荷载siRNA PEI 纳米微粒已成功应用于体内递送siRNA。该纳米微粒系统能够靶向胃癌细胞的CD44v6 受体,经PEG修饰后纳米微粒的细胞毒性降低,体内稳定性增加,与血清蛋白的非特异性结合减少,转染效率仍较高。C57BL/6小鼠尾静脉注射给予3 μg荷载siRNA PEI-PEG 纳米微粒系统后无死亡现象,也未观察到急性毒性,纳米微粒的半衰期大于30min,而荷载siRNA PEI纳米微粒的半衰期仅为13min。树枝状高聚物聚酰胺-胺(Polyamidoamine,PAMAM)已用于荷载及体内递送siRNA。PAMAM递送siRNA 的效率与其代数有较大的关系。PAMAM内部正电荷能够荷载siRNA,有效保护siRNA 在体循环过程中免受核酸酶的降解。荷载siRNA PAMAM纳米微粒能够有效地将siRNA递送至癌细胞,使其在肿瘤组织部位聚集,避免化疗产生的副作用。

        纳米脂质体是由磷脂、胆固醇等膜材包合而成,具有类似生物膜结构的双分子小囊。阳离子脂质可与带负电的siRNA 通过静电相互作用将核酸结合到脂质囊泡上形成脂质纳米微粒复合物。利用脂质纳米微粒体内递送siRNA 可显著提高siRNA对靶基因的沉默效果。其中阳离子脂质体,如1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)已广泛用于制备荷载siRNA 脂质纳米微粒。目前,文献报道将DOTAP、鱼精蛋白硫酸盐以及siRNA制成新型脂质纳米微粒,得到的三重脂质纳米微粒粒径大约在100 nm左右,该脂质纳米微粒的基因沉默效率高于荷载siRNA DOTAP脂质纳米微粒,同时也证实了鱼精蛋白可以有效地压缩核酸类物质。采用阳离子以及融合类脂制备稳定的荷载核酸脂质纳米微粒能够有效地增加胞内摄取以及内含体逃逸。静脉注射荷载抗乙型肝炎病毒的siRNA 脂质纳米微粒能够有效地延长其血浆半衰期。Judge AD等制备了荷载抗PLK1 和KSP的siRNA脂质纳米微粒,小鼠尾静脉注射该脂质纳米微粒在小鼠肝脏肿瘤模型以及皮下肿瘤模型均表现出抗肿瘤活性。脂质纳米载体是现在较为热门的siRNA 体内递送系统,但是其毒性以及易引起siRNA 脱靶效应等问题,限制了其在体内的应用。后续可考虑对脂质纳米微粒进行PEG化修饰,以及降低其毒性;采用有效的配体修饰脂质纳米微粒,有效地靶向靶细胞及靶组织,降低其脱靶效应。目前PEG 化的多柔比星已成功在美国上市,这也显示了脂质纳米微粒在临床应用方面的潜力。

siRNA纳米微粒系统的临床试验
        目前,荷载siRNA 纳米微粒系统用于体内递送siRNA已有部分进入临床试验阶段。美国Calando公司的CALAA-01纳米微粒系统进行体内递送siRNA,用药后患者疾病稳定,肿瘤生长缓慢,肿瘤组织切片检测到纳米微粒及siRNA。转移性黑色素瘤患者在不同治疗周期阶段治疗后,在自愿的基础上获得活检组织3 例,与用药前组织水平相比,核糖核苷酸还原酶M2 mRNA和蛋白量降低,并显示siRNA纳米微粒呈剂量依赖性地在肿瘤组织中累积,证明了siRNA 可在人体肿瘤中引起RNA干扰效应,可用作特异性基因疗法。其他,如加拿大Tekmira公司、美国Alnylam公司和美国Marina公司等也有荷载siRNA纳米微粒系统产品进入临床前或者临床试验。具体欢迎关注我们所供应科研产品——阿霉素-siRNA共载脂质体等。






                                                                    

                

                

                           




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